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三聚氰胺檢測方法

更新日期:2018年6月25日 大字 小字
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檢測方法
利用酶聯免疫吸附測定法用食品及飼料中三聚氰胺的定量測定。
檢測原理
酶聯免疫吸附測定法定量測定三聚氰胺殘留。利用萃取液通過均質及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進行免疫測定。先將三聚氰胺酶標記物,樣品萃取物及標准加入到已經包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應。在30分鍾的孵育過程中,樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標記物競爭結合微孔中的三聚氰胺抗體,孵育30分鍾後洗掉小孔中所有沒有結合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標記物。在用去離子水清洗結束後,每孔中加入清澈的底物溶液,結合的酶標記物將無色的底物轉化爲藍色的物質。孵育30分鍾後停止此反應,根據各孔顔色深淺進行數據讀取。依據標准的顔色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。 

實驗所需設備及材料
三聚氰胺檢測試劑盒(目前常用進口試劑有美國Abraxis公司和美國Beacon公司的)
酶標儀一台(配有450nm濾光片)
1-5ml可調移液器
100-1000ul可調移液器. 
20-200ul可調移液器.
蒸餾水或去離子水.. 
可吸取50ul的移液器及吸頭. 
可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸頭. 
吸水紙或相當的吸水材料. 
450nm的酶標儀. 
計時器. 
洗瓶 
混旋器. 
20mM PBS: 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸馏水定容至1000ml.


注意事項 
最好配套使用試劑,不要同其它公司的産品混用,不要將不同批次的産品混用。 
樣品稀釋或含有雜質很可能對結果的准確性有影響。 
不要使用過期的産品。 
使用之前將所有試劑回升至室溫,但不要放置超過24小時。 
三聚氰胺屬于有毒性的化學品,請小心處理。 
停止液是1N鹽酸,避免接觸皮膚。 

样品制备 (以美国Beacon试剂为例)
濕的寵物食品萃取方法(稀釋倍數:100) 
均質樣品至布丁狀。 
称取2g样品加入10mL 60%甲醇/水溶液,并剧烈振荡。 
超聲萃取1分鍾。 
漩渦混合1分鍾,然後靜置5分鍾,使樣品分層。 
3000 g 室温离心5分钟。 
用玻璃纖維濾紙過濾上清液,並將萃取液收集于一幹淨試管中。 
用样品稀释液将滤液20倍稀释(如:0.1mL滤液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS) 
移取150 ul 进行分析。 
注意:用此方法測定了8個添加有15ppm三聚氰胺的貓糧(非要求召回),回收率範圍爲75%-117%。 
本方法只可作爲樣品篩選方法,不可作爲最終確認方法。 

小麥面筋蛋白萃取方法:(稀釋倍數:500) 
1.均質或混勻小麥面筋蛋白樣品。 
2.称取0.2g均质好的样品加入10mL 酸化的60%甲醇/水溶液(1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水)。 
3.漩渦混合並超聲萃取,使樣品溶解(確保樣品中沒有結塊)。 
4.用样品稀释液稀释萃取液按照1:10比例。(0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS)。 
5.10000轉/分離心上清液10分鍾。 
6.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液,並將萃取液收集于一幹淨試管中。 
7.移取150 ul 进行分析。 

注意:如果樣品中含有大量的添加物,需要加入更大量的萃取溶液,以保證萃取效率。
操作人依據自己的判斷力,如果測試結果比較高,需要加入兩倍的萃取溶液(0.2/20mL),進行二次測定。 

幹的寵物食品萃取方法(稀釋倍數:200) 
1.質器均質幹的寵物飼料樣品。 
2.称取1g样品加入10mL 60%甲醇/水溶液,并剧烈振荡。 
3.超声萃取1分钟。漩渦混合1分鍾,然後靜置5分鍾,使樣品分層。 
4.3000 g 室温离心5分钟。 
5.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液,並將萃取液收集于一幹淨試管中。 
6.用样品稀释液将滤液20倍稀释(如:0.1mL滤液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS) 
7.移取150 ul 进行分析。 

免疫测定过程 (注意: 标准及样品最好做平行试验以增加准确度) 
將所有試劑及樣品回升至室溫20-280C,但不要放置超過24小時。 
從鋁箔袋中拿出要求數量的微孔條,放入幹燥劑並重新封好袋子以免微孔條受潮 
吸取150ul标准、样品到对应微孔中,必须保证每种溶液使用干净的吸头吸取,避免交叉污染。 加入50ul三聚氰胺酶标记溶液到每个小孔中。 
混合60秒,20-28攝氏度下孵育30分鍾。 
將微孔中的溶液倒入水槽中,用蒸餾水完全充滿微孔,震蕩後倒掉,重複三次,總共四次洗板。 
在吸水紙上拍打,盡可能將水拍幹。 
每個微孔中加入100ul底物溶液。 
20-28攝氏度下,孵育30分鍾。 
每個微孔中加入100ul停止液。 
450nm下讀板。 

結果分析 
半定量的结果是由样品的吸光率与标准的吸光率的简单对比而来判定:样品的颜色比标准的颜色浅则三聚氰胺的浓度比标准样的浓度高, 样品的颜色比标准的颜色深则三聚氰胺的浓度比标准样的浓度低。 
定量分析需要绘制以标准样的吸光率为X轴,以标准样的浓度的半对数为Y轴的曲线图.依据标准样吸光率的点画成一直线,如此样品的光吸收率可在线上找到,与此相对应的Y轴则为样品的浓度,样品光吸收率范围应比标准样的最底范围高,比最高范围低, 即可说明此样品中三聚氰胺的含量大于500ppb或小于20ppb。